ANOVA: quando i gruppi sono più di due

Supponiamo di voler confrontare tre diversi farmaci per il controllo del colesterolo. Alla fine dello studio abbiamo tre medie, una per ciascun gruppo, e vogliamo sapere se almeno una di esse è diversa dalle altre in modo non attribuibile al caso. La tentazione immediata è di fare tretest tseparati: farmaco A contro farmaco B, farmaco A contro farmaco C, farmaco B contro farmaco C. Sembra ragionevole. Eppure è sbagliato.

Il problema si chiama inflazione del rischio di errore di tipo I. Quando si usa la soglia convenzionale di 0.05, ogni test t ha una probabilità del cinque per cento di produrre un falso positivo, ossia di dichiarare significativa una differenza che in realtà non esiste. Se si eseguono tre test separati, la probabilità complessiva di commettere almeno un errore del genere sale a quasi il quattordici per cento. Con sei confronti salirebbe ancora. Con dieci confronti supererebbe il quaranta per cento. Si sta cercando differenze reali, ma si sta costruendo un sistema che le inventa sempre più spesso.

L’analisi della varianza — ANOVA, dall’inglese Analysis of Variance — risolve questo problema testando tutti i gruppi simultaneamente in un unico test, controllando il rischio di errore al livello desiderato indipendentemente dal numero di gruppi. È uno degli strumenti più utilizzati nella ricerca biomedica, psicologica e nelle scienze sociali, e la sua logica, una volta capita, illumina un modo di pensare alla variabilità che va ben oltre il test specifico.

L’idea centrale: scomporre la variabilità

Il nome analisi della varianza rivela già tutto sulla sua logica. L’ANOVA non confronta direttamente le medie dei gruppi: scompone la variabilità totale dei dati in due componenti e confronta la loro entità relativa.

Immagina di avere i dati di sessanta pazienti distribuiti in tre gruppi di venti ciascuno. Se misuri la pressione arteriosa di tutti e sessanta, osservi una certa variabilità totale: i valori si disperdono intorno alla media complessiva. Questa variabilità totale ha due origini distinte. La prima è la variabilità tra i gruppi: le medie dei tre gruppi non sono tutte identiche e quanto si discostano dalla media complessiva contribuisce alla variabilità totale. La seconda è la variabilità entro i gruppi: anche all’interno di ciascun gruppo i valori individuali si disperdono intorno alla media del gruppo, per effetto della variabilità biologica naturale e dell’errore di misurazione.

La statistica F — il cuore dell’ANOVA — è il rapporto tra queste due componenti: variabilità tra i gruppi divisa per variabilità entro i gruppi. Se i gruppi hanno medie molto diverse rispetto alla variabilità interna, F è grande: il segnale è forte rispetto al rumore di fondo. Se le medie dei gruppi sono simili rispetto alla variabilità interna, F è vicina a uno: non c’è nulla da spiegare oltre la naturale dispersione dei dati.

Il parallelo con il test t è diretto. Anche il test t è un rapporto segnale-rumore: differenza tra le medie divisa per l’errore standard. L’ANOVA generalizza questa logica a più di due gruppi, e con due soli gruppi produce un risultato matematicamente equivalente al test t. La statistica F con due gruppi è esattamente il quadrato della statistica t corrispondente: i due test sono la stessa cosa vista da angolazioni diverse.

La statistica F e la distribuzione F

Quando l’ipotesi nulla è vera, cioè quando tutte le medie nella popolazione sono uguali, la statistica F segue una distribuzione F di Fisher-Snedecor, che dipende da due parametri chiamati gradi di libertà. Il primo è il numero di gruppi meno uno, e misura la dimensione del numeratore, ossia quanta variabilità tra i gruppi stiamo stimando. Il secondo è il numero totale di osservazioni meno il numero di gruppi, e misura la dimensione del denominatore, ossia quanta variabilità entro i gruppi stiamo stimando.

La distribuzione F è sempre positiva essendo un rapporto di varianze e ha una forma asimmetrica verso destra. Sotto l’ipotesi nulla, la maggior parte dei valori F si concentra vicino a uno; valori molto grandi sono rari. Ilp-valuedell’ANOVA è la probabilità di osservare un valore F almeno altrettanto grande di quello calcolato, assumendo che tutte le medie nella popolazione siano uguali. Un p-value piccolo segnala che la variabilità tra i gruppi è troppo grande per essere spiegata dalla sola variabilità casuale interna ai gruppi.

Cosa dice e cosa non dice l’ANOVA

Qui sta il punto che più spesso viene frainteso nella pratica. Un p-value significativo nell’ANOVA dice che almeno una media è diversa dalle altre. Non dice quale, non dice quante, non dice di quanto. Il test globale dell’ANOVA è un testomnibus: rileva la presenza di almeno una differenza nel sistema, ma non la localizza.

Per identificare quali coppie di gruppi differiscono in modo statisticamente significativo, servono i confronti multipli post-hoc, dunque quelle analisi successive che si eseguono solo dopo aver ottenuto un p-value significativo nell’ANOVA. I metodi post-hoc più comuni nella letteratura biomedica sono il test di Tukey, il test di Bonferroni e il test di Scheffé, ognuno con un approccio diverso al controllo del rischio complessivo di errore.

Il test di Tukey — formalmente chiamato Tukey’s Honest Significant Difference — è probabilmente il più usato quando si vogliono confrontare tutte le possibili coppie di gruppi. Controlla il tasso di errore per famiglia di confronti garantendo che la probabilità complessiva di commettere almeno un falso positivo nell’intera serie di confronti non superi il cinque per cento. È un equilibrio ragionevole tra controllo dell’errore e potenza statistica.

La correzione di Bonferroni è più conservativa. Divide la soglia di significatività per il numero di confronti eseguiti, richiedendo a ciascun test individuale una soglia più stringente. È semplice da applicare e da comunicare, ma tende a essere eccessivamente prudente quando il numero di confronti è grande in quanto aumenta il rischio di non rilevare differenze reali. Il test di Scheffé è il più conservativo di tutti, ma ha il vantaggio di essere valido per qualsiasi combinazione lineare di medie, non solo per i confronti a coppie.

La scelta del metodo post-hoc non è puramente tecnica: riflette decisioni su quanti confronti si vogliono fare, se erano pianificati prima di vedere i dati o sono emersi dopo e quanto si è disposti a pagare in termini di potenza per controllare il rischio di falsi positivi. Confronti pianificati a priori, quind specificati nel protocollo prima della raccolta dei dati, godono di più libertà metodologica rispetto ai confronti esplorativi condotti dopo aver visto i risultati.

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Le assunzioni dell’ANOVA

Come il test t, l’ANOVA si appoggia su alcune assunzioni che, se violate in modo sostanziale, possono rendere i risultati inaffidabili. Le tre principali sono la normalità, l’omoschedasticità e l’indipendenza delle osservazioni.

Normalità

L’assunzione di normalità richiede che la variabile dipendente sia distribuita normalmente all’interno di ciascun gruppo. Con campioni sufficientemente grandi, il teorema del limite centrale garantisce che la distribuzione delle medie campionarie si avvicini alla normale anche quando i dati originali non lo sono. Con campioni piccoli, la normalità va verificata, tipicamente con un Q-Q plot o con un test formale come quello di Shapiro-Wilk, tenendo presente che con campioni molto piccoli questi test hanno poca potenza e con campioni grandi sono troppo sensibili a deviazioni irrilevanti.

Omoschedasticità

L’omoschedasticità — termine che significa letteralmente “uguale dispersione” — è l’assunzione che le varianze dei gruppi nella popolazione siano tutte uguali. È analoga all’assunzione di uguaglianza delle varianze nel test t classico, e si può verificare con il test di Levene o di Bartlett. Quando viene violata in modo sostanziale, soprattutto in combinazione con campioni di dimensioni diverse, l’ANOVA classica può produrre p-value distorti. In questi casi esiste una variante robusta, l’ANOVA di Welch, che non richiede l’omoschedasticità e si comporta in modo analogo al test di Welch per due campioni.

Indipendenza delle osservazioni

L’indipendenza delle osservazioni richiede che i valori misurati su soggetti diversi non siano collegati tra loro. Quando questa assunzione è violata, ad esempio perchè si sta lavorando con misurazioni ripetute sugli stessi soggetti nel tempo o con soggetti raggruppati per centro o per famiglia, l’ANOVA a misure ripetute o i modelli misti sono le alternative appropriate.

Oltre l’ANOVA a una via: fattori multipli e interazioni

L’ANOVA che abbiamo descritto fino a qui è l’ANOVA a una via — one-way ANOVA — che considera un solo fattore di raggruppamento. Nella ricerca reale è spesso necessario considerare più fattori simultaneamente. Per questi casi l’ANOVA si generalizza naturalmente in questa direzione.

L’ANOVA a due vie — two-way ANOVA — considera due fattori di raggruppamento e la loro interazione. Supponiamo di voler studiare l’effetto di tre diete e di due livelli di attività fisica sul livello di trigliceridi. L’ANOVA a due vie testa separatamente l’effetto principale della dieta, l’effetto principale dell’attività fisica, e l’interazione tra i due. L’interazione è il punto concettualmente più ricco: c’è interazione quando l’effetto di un fattore dipende dal livello dell’altro. Se la dieta A è la migliore per i soggetti sedentari ma non per quelli attivi, i due fattori interagiscono ed ignorare questa interazione produrrebbe conclusioni fuorvianti.

Quando i fattori sono più di due, si entra nel territorio dell’ANOVA multivariata o dei modelli lineari generali. Questi strumenti sebben più complessi, condividono la stessa logica di fondo: scomporre la variabilità totale in componenti attribuibili ai diversi fattori e alle loro interazioni e valutare la significatività di ciascuna componente rispetto alla variabilità residua non spiegata.

Quando l’ANOVA non basta: le alternative non parametriche

Quando le assunzioni dell’ANOVA sono violate in modo sostanziale e non correggibile — distribuzioni molto asimmetriche, outlier estremi, campioni molto piccoli — esistono alternative non parametriche che non richiedono l’assunzione di normalità.

Il test di Kruskal-Wallis è l’alternativa non parametrica all’ANOVA a una via. Invece di lavorare sui valori originali, lavora sui ranghi. Sostituisce ogni valore con la sua posizione nel ranking complessivo dei dati e confronta la distribuzione dei ranghi tra i gruppi. Non richiede normalità ed è robusto a distribuzioni asimmetriche e a outlier, ma ha in genere meno potenza dell’ANOVA quando la normalità è soddisfatta. Per i confronti post-hoc dopo un Kruskal-Wallis significativo, si usa tipicamente il test di Dunn con correzione per confronti multipli.

Per l’ANOVA a misure ripetute, la corrispondente alternativa non parametrica è il test di Friedman, che lavora sui ranghi tenendo conto della struttura appaiata dei dati. Vale però la pena segnalare che nella pratica moderna l’ANOVA a misure ripetute classica è sempre più sostituita dai modelli misti lineari. Questo modelli non richiedono l’assunzione di sfericità, gestiscono i dati mancanti in modo più flessibile e permettono strutture di correlazione più realistiche tra le misurazioni ripetute. Il modello misto è oggi la scelta metodologicamente più solida nella maggior parte dei contesti di ricerca con misurazioni ripetute.

La scelta tra ANOVA parametrica e alternativa non parametrica non è automatica. Dipende dalla gravità della violazione delle assunzioni, dalla dimensione del campione e dall’obiettivo dell’analisi. Nella pratica, l’ANOVA è abbastanza robusta a deviazioni moderate dalla normalità con campioni ragionevolmente grandi. La scelta di un’alternativa non parametrica dovrebbe essere motivata da una valutazione concreta dei dati, non da una preferenza aprioristica.

L’ANOVA non è semplicemente un test t allargato: è un modo di pensare alla variabilità come a qualcosa che si può scomporre, attribuire e misurare.Capire che la domanda non è “queste medie sono diverse?” ma “la variabilità tra i gruppi è grande rispetto alla variabilità dentro i gruppi?” cambia il modo in cui si leggono i dati ed apre la porta a una famiglia di modelli statistici molto più ricca di quanto il nome ANOVA possa far intuire.