Uno degli errori più costosi nella ricerca clinica non si commette durante l’analisi dei dati, ma molto prima quando si decide quanti partecipanti reclutare. Se i partecipanti sono troppo pochi, lo studio non ha la potenza per rilevare un effetto reale: si potrebbe concludere con un risultato non significativo che non dimostra nulla — né che il trattamento funziona né che non funziona — o con un risultato significativo che però è limitato dal campione troppo piccolo per essere interpretato con fiducia.

Se al contrario i partecipanti sono troppi, si arruolano più partecipanti di quanti necessario, si spendono risorse che non cambieranno la conclusione, e — nei trial con trattamenti sperimentali — si viola il principio etico di minimizzare l’esposizione a interventi non ancora validati.

Il calcolo della sample size non è un passaggio tecnico da delegare in fretta prima di iniziare il reclutamento. È una decisione scientifica che cristallizza tutte le assunzioni dello studio — sull’effetto atteso, sulla variabilità della misura, sull’errore che si è disposti a tollerare — e che deve essere documentata nel protocollo con la stessa cura delle analisi principali.

Prima del calcolo: capire cosa si sta chiedendo

Il calcolo della numerosità campionaria risponde a una domanda precisa: quante osservazioni servono per avere una probabilità sufficientemente alta di rilevare un effetto di una certa dimensione, assumendo che quell’effetto esista davvero? Ogni parola di questa frase contiene un’assunzione che deve essere quantificata prima di aprire qualunque software.

Il punto di partenza è l’ipotesi statistica. Nella maggior parte degli studi clinici si lavora con un framework di ipotesi nulla e alternativa: l’ipotesi nulla (H₀) afferma che non c’è differenza tra i gruppi, l’ipotesi alternativa (H₁) afferma che una differenza esiste. Il calcolo della sample size serve a dimensionare lo studio in modo che, se H₁ è vera, si abbia una probabilità accettabile di rifiutare H₀.

Il calcolo della sample size non è un passaggio tecnico da delegare in fretta. È una decisione scientifica che cristallizza tutte le assunzioni dello studio.

I quattro elementi fondamentali

Qualunque sia il disegno dello studio e il tipo di endpoint, il calcolo della sample size richiede sempre quattro elementi. Cambiano i valori, cambia il modo in cui entrano nella formula di calcolo, ma la struttura non cambia mai.

1. Il livello di significatività α

Il primo elemento del calcolo della sample size è il livello di significatività, indicato con la lettera greca alfa (α). Indica la probabilità di commettere un errore di tipo I, cioè di rifiutare H₀ quando è vera, concludendo che c’è un effetto quando in realtà non c’è. Si tratta, in termini pratici, del rischio di affermare un’efficacia che non esiste.

Per convenzione si fissa a 0.05 nella maggior parte degli studi clinici, a 0.025 in alcuni contesti regolatori con test a una coda, e a soglie molto più stringenti — fino a 5×10⁻⁸ — nella ricerca genomica, dove il numero di test simultanei è nell’ordine delle centinaia di migliaia. La scelta di α non è mai puramente statistica: è una scelta sul rischio che si è disposti a correre. In un trial che porta a un’approvazione regolatoria, le conseguenze di un falso positivo sono enormi — trattamenti inefficaci distribuiti su scala di popolazione — e questo giustifica soglie conservative.

2. La potenza statistica (1 − β)

La potenza statistica, espressa nella forma (1 − β), è la probabilità di rilevare un effetto reale quando questo esiste, ovvero di rifiutare H₀ quando H₁ è vera. Il suo complemento, β, è la probabilità di errore di tipo II: concludere che non c’è effetto quando invece c’è.

Per convenzione si lavora con potenze tra l’ 80% e il 90%, il che significa accettare rispettivamente un 20% o un 10% di probabilità di perdere un effetto reale. La scelta non è indolore: passare dall’ 80% al 90% aumenta la numerosità campionaria di circa il 30%, a parità di tutto il resto.

In studi con endpoint primari di sopravvivenza o in contesti regolatori, il 90% è spesso lo standard atteso. Per gli studi esplorativi o di fase II, l’ 80% può essere sufficiente. In casi selezionati — trial con endpoint rari, studi registrativi su popolazioni vulnerabili o contesti in cui le conseguenze di un falso negativo sono particolarmente gravi — la potenza può essere portata al 95%.

3. La dimensione dell’effetto atteso

Questo è il cuore del calcolo e la fonte di maggiore incertezza ed è anche l’elemento meno compreso da chi si avvicina al calcolo della sample size per la prima volta. Stimare la dimensione dell’effetto significa rispondere a una domanda concreta: di quanto ci aspettiamo che i due gruppi differiscano? Per un endpoint continuo sarà la differenza tra le medie; per un endpoint binario sarà la differenza tra proporzioni o il rischio relativo; per un endpoint di sopravvivenza sarà l’hazard ratio.

La dimensione dell’effetto non si sceglie liberamente. Non è un parametro arbitrario: deve essere giustificata da fonti accurate e documentabili. Le fonti principali sono i dati di studi precedenti — pilota, osservazionali o trial di fase II — e la letteratura pubblicata su popolazioni simili. In alcuni casi si ricorre al giudizio clinico su quale sia la differenza minima clinicamente rilevante (MCID, Minimal Clinically Important Difference). Il MCID è un concetto cruciale: non basta che un effetto sia statisticamente rilevabile, deve essere abbastanza grande da modificare o orientare la pratica clinica. Uno studio dimensionato per rilevare una differenza di 0.3 punti su una scala da 0 a 100 può essere statisticamente impeccabile e clinicamente irrilevante.

La dimensione dell’effetto agisce come una bilancia: più grande è l’effetto atteso, più piccolo è il campione necessario e viceversa. L’errore più comune è sovrastimare la dimensione dell’effetto per rendere lo studio più fattibile. Il risultato è uno studio dimensionato su un effetto irrealisticamente grande che si rivela, di fatto, molto inferiore: se l’effetto reale è più piccolo di quello ipotizzato, lo studio non avrà la potenza per rilevarlo. Ma la bilancia può sbilanciarsi anche nell’altra direzione: assumere un effetto talmente piccolo da richiedere una numerosità enorme porta a rilevare come statisticamente significativi effetti clinicamente trascurabili, resi significativi dalla sola forza del campione. È qui che il MCID torna centrale: la domanda non è solo “riusciamo a vedere questo effetto?” ma “se lo vediamo, cambia qualcosa nella pratica clinica?”

4. La variabilità della misura

Per gli endpoint continui, la formula del campione richiede una stima della deviazione standard della misura nella popolazione. Anche questa deve essere ricavata da fonti esterne — dati pilota, letteratura, registri — e non dalla distribuzione osservata nei dati dello studio stesso, che non sono ancora disponibili al momento del calcolo.

Sovrastimare la variabilità porta a campioni più grandi del necessario; sottostimarla porta a studi sottodimensionati. Quando l’incertezza sulla variabilità è elevata, la pratica corretta è condurre un’analisi di sensibilità: calcolare la sample size per diversi valori plausibili della deviazione standard e valutare quanto i risultati cambiano. Se una piccola variazione nell’assunzione sulla variabilità cambia radicalmente la numerosità richiesta, l’incertezza su quel parametro merita attenzione prima di finalizzare il disegno.

Le formule: cosa usare e quando

Per calcolare la sample size sono presenti numerose formule a seconda dei parametri a disposizione su cui eseguire il calcolo. Le formule qui sotto coprono i casi più frequenti nella pratica clinica. Per ognuna sono indicati i parametri richiesti e le condizioni di applicabilità. La scelta della formula giusta precede qualunque software: se non si è in grado di leggere e interpretare la formula, non si è in grado di valutare se il risultato restituito sia accurato e adatto alla situazione clinica specifica.

Confronto tra due medie indipendenti (endpoint continuo)

La formula per calcolare la numerosità per ciascun gruppo è:

in cui$n$è la numerosità campionaria che si intende calcolare,$z_\frac{\alpha}{2}$è il quantile normale per il livello di significatività (solitamente fissato a 1.96 se alfa = 0.05 a due code),$z_{\beta}$è il quantile normale per la potenza (è pari a 0.84 per potenza all’80%, 1.28 per potenza al 90%),$\sigma$è la deviazione standard comune nei due gruppi e$\delta$è la differenza attesa tra le medie.

Confronto tra due proporzioni (endpoint binario)

Quando si confrontano due proporzioni per cui si ha un endpoint binario (successo/insuccesso), la formula è:

$n=(z_{\frac{\alpha}{2}}+z_{\beta})^{2}\cdot\frac{[p_{1}(1-p_{1})+p_{2}(1-p_2)]}{(p_{1}-p_{2})^{2}}$

in cui$n$è la numerosità campionaria che si sta cercando,$p_1$e$p_2$sono le proporzioni attese, mentre$z_\frac{\alpha}{2}$e$z_{\beta}$sono gli stessi valori come definiti sopra.

Endpoint di sopravvivenza

Quando si lavora con gli endpoints di sopravvivenza, il calcolo si focalizza sul numero degli eventi necessari, dunque non sul numero di pazienti, il cui valore è determinato in un secondo momento. Dunque per questo tipo di endpoint il primo passo è calcolare il numero di eventi necessari utilizzando la seguente formula:

$E = 4 \cdot\frac{(z_{\frac{\alpha}{2}}+z_{\beta})^2}{[ln(HR)]^2}$

in cui$E$è appunto il numero di eventi necessari,$HR$è l’hazard ratio atteso tra i due gruppi (in questo caso si usa il logaritmo naturale$ln$) e gli altri valori$z_\frac{\alpha}{2}$e$z_{\beta}$sono quelli già visti.

Dopo aver determinato il numero necessario di eventi, il passo successivo è il calcolo della numerosità che è pari a:

$N = \frac{E}{\text{probabilità attesa di evento nel follow-up}}$

La probabilità attesa di evento nel follow-up non è un parametro direttamente osservabile. Essa va stimata a partire dal tasso di eventi atteso nella popolazione e dalla durata del follow-up pianificata. In pratica, se si assume un tasso di eventi costante che indichiamo con$\lambda$e un follow-up di durata$T$, la probabilità di osservare l’evento è approssimabile come$1-e^{(-{\lambda}T)}$. Anche questa stima deve provenire dalla letteratura o da dati pilota. Sovrastimare questo parametro porta a reclutare meno pazienti del necessario, esattamente come accade con la sovrastima della dimensione dell’effetto negli endpoint continui.

Assunzione per l’uso della formula

Questa formula si basa sull’assunzione che gli hazard siano proporzionali nel tempo, ovvero che il rapporto tra i rischi istantanei nei due gruppi rimanga costante per tutta la durata del follow-up. Quando questa assunzione non è soddisfatta — per esempio nei casi in cui l’effetto del trattamento si manifesta con ritardo o in cui le curve di sopravvivenza si incrociano — la formula sovrastima o sottostima il numero di eventi necessari, e l’hazard ratio perde il suo significato di misura sintetica dell’effetto. In questi contesti è necessario ricorrere a metodi alternativi, come i test weighted log-rank o le misure di area sotto la curva di sopravvivenza.

Studio crossover (endpoint continuo)

Quando si lavora con studi crossover la numerosità campionaria si può determinare applicando la seguente formula:

$n = (z_{\frac{\alpha}{2}}+z_{\beta})^{2}\cdot\frac{2\sigma_{d}^{2}}{\delta^2}$

in cui$d$è la deviazione standard delle differenze intra-soggetto (tipicamente pari a$\sigma_d = \sigma\sqrt{2(1-\rho)}$, in cui$\rho$è la correlazione tra le due misurazioni) ed$n$è il numero totale di soggetti (ognuno riceve entrambi i trattamenti).

Studio cluster-randomizzato

Quando si lavora su studi cluster con randomizzazione la numerosità si calcola come:

$n^*=n\cdot[1+(m-1)\cdot ICC]$

in cui$n$è la numerosità campionaria calcolata per un disegno parallelo standard,$m$è la dimensione media del cluster e$ICC$è l’intraclass correlation coefficient che misura la somiglianza tra partecipanti dello stesso cluster, ed$n^*$è la numerosità effettiva richiesta per lo studio (inflation factor).

Trial di non inferiorità (endpoint continuo)

Quando si definisce la numerosità campionaria per un trial di non inferiorità con endpoint continuo, la formula da applicare è:

$n = (z_{\alpha}+z_{\beta})^{2}\cdot\frac{2\sigma^{2}}{(\Delta-\delta)^{2}}$

in cui$\Delta$è il margine di non-inferiorità (pre-specificato su base clinica),$\delta$è la differenza attesa tra i trattamenti (spesso 0 se si assume equivalenza pratica),$z_\alpha$è il quantile ad una coda (pari a 1.645 per$\alpha=0.05$).

Quale formula scegliere?

Aggiustamenti pratici

Il calcolo base fornisce la numerosità netta, ossia il numero di partecipanti che devono completare lo studio e contribuire all’analisi primaria. Ma negli studi longitudinali una quota di partecipanti abbandonerà prima della fine: si ritira, si trasferisce, perde il follow-up, muore per cause non correlate all’endpoint. Questa quota va anticipata e incorporata nel calcolo.

Se si prevede un tasso di dropout del 20%, la numerosità deve essere aumentata dividendo per (1 − 0.20): se il calcolo base richiede 100 partecipanti per gruppo, ne vanno reclutati 125. Questa correzione assume implicitamente che il dropout sia indipendente dal trattamento e dall’outcome, un’assunzione quest’ultima che va valutata criticamente, perché un dropout sistematicamente legato all’efficacia o agli effetti avversi cambia il profilo del bias, non solo della potenza.

Se lo studio prevede analisi per sottogruppi pre-specificate con rilevanza confermativa o endpoint multipli senza una struttura gerarchica, la molteplicità deve essere gestita anche nel calcolo della sample size: il livello α da usare nella formula non è 0.05, ma il livello corretto dopo l’aggiustamento previsto, per esempio 0.025 con correzione di Bonferroni su due endpoint.

Studi di non-inferiorità

Nei trial di non-inferiorità l’obiettivo non è dimostrare che il nuovo trattamento è migliore del controllo, ma che non è peggiore di un margine pre-stabilito — il cosiddetto margine di non-inferiorità, indicato con Δ. Questa inversione logica cambia radicalmente il calcolo della sample size.

Il margine Δ deve essere definito prima dello studio, su basi cliniche e statistiche solide. Il campione deve essere abbastanza piccolo da preservare una quota sostanziale dell’effetto del controllo attivo rispetto al placebo — il cosiddettofraction retained— e deve essere giustificato nella letteratura. Un margine scelto per rendere lo studio più facile da condurre, e non per ragioni cliniche, è una delle manipolazioni più difficili da individuare e più dannose per la qualità dell’evidenza.

La numerosità in un trial di non-inferiorità dipende criticamente dall’ampiezza del margine Δ. Quanto più il margine è stretto — come dovrebbe essere per ragioni cliniche — tanto più grande è il campione richiesto. Con margini molto conservativi, la numerosità può superare quella di un trial di superiorità equivalente; con margini più ampi, può essere inferiore. In ogni caso, uno studio di non-inferiorità sottodimensionato non è uno studio conservativo: è uno studio che favorisce sistematicamente la conclusione di non-inferiorità, perché intervalli di confidenza ampi rientrano più facilmente entro il margine, indipendentemente dalla realtà.

Studi di equivalenza

I trial di equivalenza pongono una sfida ulteriore. Qui l’obiettivo è dimostrare che i due trattamenti non differiscono in nessuna direzione oltre il margine Δ — né che il nuovo sia peggiore né che sia migliore del controllo in misura clinicamente rilevante. Dal punto di vista del calcolo, questo si traduce in un doppio test: bisogna escludere simultaneamente sia l’inferiorità che la superiorità, il che in pratica si ottiene costruendo un intervallo di confidenza bilaterale e verificando che cada interamente all’interno del corridoio (−Δ, +Δ). Gli studi di equivalenza richiedono in genere campioni ancora più grandi rispetto a quelli di non-inferiorità, e la scelta del margine — che deve essere simmetrico e giustificato clinicamente in entrambe le direzioni — diventa ancora più delicata.

Strumenti per il calcolo

Esistono diversi strumenti affidabili per eseguire il calcolo, ciascuno con i propri punti di forza.

G*Powerè il software gratuito più diffuso in ambito accademico: copre un’ampia gamma di disegni sperimentali e test statistici, permette di calcolare la potenza dato il campione o la numerosità data la potenza, e produce grafici di sensibilità che mostrano come la potenza varia al variare della dimensione dell’effetto. È adatto per la maggior parte degli studi clinici standard.

R è il software più conosciuto in ambito statistico ed offre pacchetti dedicati — tra cui pwr, pwrss e TrialSize — che coprono disegni più complessi e permettono di integrare il calcolo direttamente nel flusso di analisi, facilitando documentazione e riproducibilità. Per studi con endpoint di sopravvivenza, il pacchetto gsDesign gestisce anche i disegni con analisi interim e alpha spending.

Un software molto noto in contesti regolatori èPASS: copre centinaia di disegni sperimentali, produce output dettagliati adatti alla documentazione regolatoria, e viene aggiornato regolarmente con le nuove metodologie. È lo standard de facto in molte CRO e in studi di fase III. Un’altra opzione commerciale molto usata in ambito farmaceutico ènQuery, che ha funzionalità specifiche per disegni adattativi e trial bayesiani.

La scelta dello strumento dipende dal contesto — accademico o industriale, esplorativo o regolatorio — ma la logica del calcolo è la stessa. Ciò che occorre ricordare è che nessuno strumento sostituisce la comprensione della formula che sta usando. Se non si è in grado di leggere e interpretare la formula alla base del calcolo, non si è in grado di valutare se il risultato restituito sia accurato e adatto alla situazione clinica specifica. Il software esegue: il giudizio metodologico resta sempre in capo a chi esegue il calcolo.

Come documentare il calcolo nel protocollo

Il calcolo della sample size non deve solo essere eseguito, ma deve essere documentato in modo che chiunque legga il protocollo possa riprodurlo e valutarne le assunzioni. La sezione dedicata deve riportare: il tipo di test statistico usato per il calcolo, tutti i parametri inseriti con le loro fonti, il software e la versione, il risultato finale con e senza l’aggiustamento per dropout, e — quando rilevante — un’analisi di sensibilità che mostri come la numerosità cambia al variare delle assunzioni chiave.

Una pratica che vale la pena adottare, quando possibile e non eccessivamente onerosa per il lettore, è riportare esplicitamente le formule alla base del calcolo. Farlo facilita la lettura, aumenta la riproducibilità e rende immediatamente evidente cosa si sta misurando e perché nel contesto specifico dello studio. La trasparenza non è un optional per chi vuole soddisfare i revisori. Questa è la garanzia che le assunzioni su cui si basa lo studio possano essere discusse, criticate e — se necessario — corrette prima che il reclutamento inizi.

Cosa fare operativamente: i sei passi

Il calcolo della sample size può sembrare un esercizio astratto fino a quando non ci si siede davanti a un protocollo vuoto. Questi sono i passi nell’ordine in cui vanno affrontati, ognuno deve essere completato prima di passare al successivo.

Passo 1 —Definire l’endpoint primario e il tipo di analisi

La formula da usare dipende interamente da questa scelta. Un confronto tra medie richiede una formula diversa da un confronto tra proporzioni, che richiede una formula diversa da un’analisi di sopravvivenza (vedi formule sopra). Scegliere la formula sbagliata invalida tutto il calcolo che segue.

Passo 2 —Raccogliere le stime dei parametri

Dalla letteratura o da dati pilota: la dimensione dell’effetto atteso, la deviazione standard per gli endpoint continui, il tasso di eventi per gli endpoint binari o di sopravvivenza. Ogni stima deve avere una fonte documentabile — non “è plausibile” ma “è coerente con i dati di [studio X, anno Y]”.

Passo 3 —Fissare α e la potenza con una giustificazione

Non ci si riduce al “usiamo i valori standard”. Se il contesto è esplorativo, l’ 80% è difendibile. Se il contesto è regolatorio o l’endpoint è di sopravvivenza, il 90% è più appropriato. La scelta deve essere motivata nel protocollo.

Passo 4 —Eseguire il calcolo e fare almeno un’analisi di sensibilità

Verificare che i parametri inseriti nel software corrispondano alle stime raccolte, poi variare i parametri più incerti per capire quanto il risultato sia robusto alle assunzioni. Se piccole variazioni producono grandi cambiamenti nella numerosità, l’incertezza su quel parametro va affrontata prima di procedere.

Passo 5 —Aggiustare per il dropout atteso

Tenendo conto del disegno: in uno studio crossover il dropout si gestisce diversamente che in uno studio parallelo. La correzione deve essere documentata separatamente dal calcolo base, in modo che il lettore veda sia la numerosità netta che quella lorda.

Passo 6 —Documentare tutto nel protocollo

Parametri, fonti, formula, software, risultato lordo e netto. Un calcolo non documentato è un calcolo che non esiste — e che nessun revisore, nessun comitato etico, nessuna autorità regolatoria accetterà come tale.

Una nota finale sul ricalcolo in corso di studio

In alcuni disegni adattativi è prevista la possibilità di riesaminare la numerosità campionaria a metà studio, sulla base di dati intermedi — tipicamente la varianza osservata o il tasso di eventi, ma non la dimensione dell’effetto. Questo ricalcolo, se pianificato nel protocollo e condotto in cieco rispetto all’effetto del trattamento, è metodologicamente accettabile e può aumentare la robustezza dello studio rispetto a errori nelle assunzioni iniziali.

Quello che non è accettabile è aumentare la numerosità a metà studio perché i risultati intermedi sembrano negativi, senza che questo fosse previsto nel disegno originale. Un ricalcolo non pianificato, condotto guardando i dati di efficacia, introduce un bias che non ha rimedio statistico — e che nelle submission regolatorie viene sistematicamente identificato.

Il calcolo della sample size è la prima analisi statistica che si fa su uno studio. Vale la pena farlo bene.